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卡梅德生物技术快报｜如何制备单克隆抗体：小众禽类靶点单抗制备实操流程：双载体抗原交叉筛选完整工艺记录
一、提出问题小众禽类 Caspase 靶点单抗制备实操难点分子生物学实验室开展非模式生物蛋白抗体制备时经常面临抗原设计、筛选体系两大实操难题。针对禽类特有凋亡蛋白鸡 Caspase-18常规单抗原制备方案存在大量实操短板单一全长抗原筛选杂克隆多、小片段抗原免疫效价低、同源标签造成大量假阳性整套流程失败率高极大消耗实验室试剂、动物与人力成本。 多数实验人员仅掌握哺乳动物靶点单抗制备流程缺乏禽类特有蛋白差异化抗原设计思路导致鸡 Caspase-18相关蛋白水平试验无法开展缺少标准化实操流程作为试验参照。二、分析问题常规单抗制备方案适配鸡 Caspase-18的实操缺陷抗原结构适配缺陷鸡 Caspase-18含双 DED 结构域与 p20 催化核心全长蛋白免疫获得的抗体多靶向 N 端非功能区无法用于蛋白活化剪切机制研究p10 片段分子量仅 10kDa抗原表位数量不足小鼠免疫应答微弱标签同源筛选缺陷免疫、筛选使用相同融合标签时ELISA 筛选孔大量出现抗标签假阳性信号大幅增加阳性克隆筛选工作量亲和力筛选缺失常规方案仅验证阳性结合未定量检测抗体解离常数产出低亲和力抗体无法识别细胞内源低丰度蛋白内源识别验证缺失多数单抗制备仅做外源过表达 WB 验证缺少禽类细胞内源蛋白干扰对照无法确认抗体真实应用场景有效性。 以上实操缺陷导致常规工艺无法产出适配禽类细胞试验的特异性单抗。三、解决问题双载体异源标签抗原完整实操工艺可直接复刻本试验完整记录适配鸡 Caspase-18的标准化杂交瘤单抗制备实操流程分为基因工程、蛋白表达、动物免疫、细胞融合、抗体鉴定五大实操模块基因克隆与双重组质粒构建实操 调取 GenBank chCASP18 参考序列设计带同源臂上下游引物鸡脾脏 cDNA 为模板扩增全长 1392bp、p20 片段 372bp同源重组分别构建 pET-28a-His-chCaspase-18、pGEX-6p-1-GST-chCaspase-18 p20 载体转化 DH5α 感受态挑取单克隆测序验证序列无误重组蛋白诱导、纯化实操步骤 重组质粒转化 Rosetta 感受态37℃培养至 OD₆₀₀0.6~0.81mmol/L IPTG 16℃诱导 18h菌体超声破碎GST 亲和层析填料纯化 p20 重组蛋白SDS-PAGE 结合 BSA 梯度标定蛋白浓度BALB/c 小鼠免疫与 ELISA 筛选实操 His 全长蛋白作为免疫原5 只 6 周龄 SPF 小鼠 3 次皮下多点免疫末次免疫 7 天后断尾采血GST-p20 抗原包被酶标板间接 ELISA 检测血清效价计算临界值判定阳性血清细胞融合、亚克隆与腹水纯化实操 阳性小鼠脾脏分离 B 淋巴细胞PEG4000 与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合HAT 培养基筛选杂交瘤间接 ELISA 初筛阳性孔3 轮有限稀释亚克隆获得单克隆株 3D8小鼠腹腔注射杂交瘤收获腹水正辛酸 - 饱和硫酸铵两步沉淀纯化抗体抗体多维度鉴定实操流程 分型试剂盒鉴定抗体亚型梯度稀释抗体 ELISA 拟合 Michaelis-Menten 曲线计算 Kd 值WB 分别验证 HEK293T 外源过表达、DF-1 鸡细胞内源蛋白识别效果搭配 siRNA 干扰对照验证特异性。四、实操量化数据实验室可直接对标参考整套实操流程产出全部量化试验数据可作为实验室对标参考基因扩增电泳数据全长 chCASP18 条带 1392bpp20 片段 372bp阴性对照无杂带扩增特异性良好免疫血清效价量化数据5 只小鼠血清 1∶128000 稀释后 OD₄₅₀均高于临界值 0.2197阴性佐剂小鼠无阳性信号抗体理化参数纯化后 3D8 单抗浓度 1mg/mLIgG1 亚型Kd4.809×10⁻⁹mol/L符合高亲和力科研抗体标准WB 识别量化结果外源体系稳定检出 57kDa鸡 Caspase-18全长条带同时检出 37kDa 剪切中间体DF-1 细胞 siRNA 干扰组内源蛋白信号随干扰效率提升逐步减弱空白对照组无杂带证明抗体内源识别特异性达标。实操总结这套异源双标签交叉筛选工艺针对性解决禽类小众靶点单抗制备的多重实操痛点完整流程全部标准化、可复刻产出的特异性单抗可直接用于 WB、IP、免疫荧光等分子试验填补鸡 Caspase-18检测试剂空白为同类非模式生物蛋白单抗制备提供标准化实操参考。 参考文献宁思仪陈志高露等。鸡 Caspase-18 单克隆抗体的制备与鉴定 [J]. 中国兽医杂志2026,62 (7):11-17.
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