结直肠癌作为高发恶性肿瘤免疫治疗仅对极少数错配修复缺陷的患者有效绝大多数患者仍面临治疗手段有限的困境。肿瘤微环境的复杂调控究竟是如何让免疫细胞“寸步难行”又藏着哪些未被发掘的治疗靶点友情提示原价 799 元的转录组直播课程现在提供回放视频仅需 99 元。《简说基因》也提供代分析服务任意转录组项目都只需要99元交个朋友。2022年4月《Nature Communications》杂志发表了上海交通大学医学院团队的研究成果该研究通过单细胞和空间转录组分析揭示了结直肠癌中FAP成纤维细胞与SPP1巨噬细胞的相互作用及其对免疫治疗的影响。今天我们就来拆解一下这篇生信文章Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP fibroblasts and SPP1 macrophages in colorectal cancer。研究概述本研究对结直肠癌肿瘤及癌旁组织的54103个细胞进行单细胞转录组分析明确肿瘤微环境的细胞组成特征鉴定出肿瘤特异性的FAP成纤维细胞和SPP1巨噬细胞。通过14个独立结直肠癌队列验证二者浸润呈正相关结合免疫荧光染色和空间转录组证实其紧密定位。研究发现二者的相互作用由趋化素、TGF-β和白介素-1调控可促进免疫排斥性促纤维增生结构形成限制T细胞浸润且高表达FAP或SPP1的患者抗PD-L1治疗获益较低为结直肠癌免疫治疗提供了新的潜在策略。实验设计收集5例非转移性结直肠癌患者的肿瘤组织和癌旁正常黏膜组织进行10× Genomics单细胞RNA测序对4例结直肠癌患者肿瘤组织切片进行10× Genomics Visium空间转录组测序结合流式细胞术、免疫荧光染色、ELISA实验验证细胞表型和分子表达利用CIBERSORTx算法在14个独立结直肠癌队列中验证细胞浸润特征通过生信分析解析细胞亚型、分化轨迹、细胞间相互作用及临床相关性借助IMvigor210数据集分析FAP/SPP1表达与抗PD-L1治疗疗效的关系。研究结果图1单细胞转录组图谱鉴定出结直肠癌及癌旁组织中的9种主要细胞类型各细胞类型在肿瘤和癌旁组织中的浸润程度存在差异。图2结直肠癌肿瘤微环境中多种细胞的信号通路发生重塑间充质基质细胞与髓系细胞浸润呈显著正相关且二者高浸润与患者不良生存相关。图3间充质基质细胞可分为10个亚型FAP成纤维细胞为肿瘤特异性亚型由FGFR2成纤维细胞或ICAM1梭形细胞分化而来TWIST1为其关键转录因子且高浸润与患者无进展生存期缩短相关。图4髓系细胞可分为多个亚型SPP1巨噬细胞为肿瘤特异性亚型由THBS1巨噬细胞分化而来STAT1为其关键转录因子高浸润同样与患者无进展生存期缩短相关。图5FAP成纤维细胞与SPP1巨噬细胞的浸润在结直肠癌队列中高度相关二者均高浸润的患者生存预后最差且蛋白水平在肿瘤组织中显著升高免疫荧光证实二者在组织中紧密共定位。图6空间转录组证实FAP成纤维细胞与SPP1巨噬细胞在结直肠癌组织中共同定位且围绕恶性上皮细胞分布其所在区域富集细胞外基质相关通路同时伴随淋巴细胞浸润排斥。图7FAP成纤维细胞与SPP1巨噬细胞通过多种配体-受体对发生相互作用趋化素为关键调控分子SPP1巨噬细胞可通过分泌TGFB1、IL1A/IL1B促进FAP成纤维细胞的细胞外基质重塑。图8FAP成纤维细胞与SPP1巨噬细胞均高浸润的结直肠癌为免疫排斥型微环境虽具有高肿瘤新抗原特征但淋巴细胞浸润不足且高表达FAP/SPP1的患者抗PD-L1治疗响应率低、生存预后差同时提出二者相互作用调控结直肠癌微环境的工作模型。数据分析生信分析本研究涉及的组学技术包括单细胞RNA测序scRNA-seq、空间转录组测序ST、批量RNA测序bulk RNA-seq、基因芯片。单细胞RNA测序• 原始测序数据经bcl2fastq2转换为fastq文件FastQC进行质量控制• Cell Ranger完成序列比对和定量• Seurat包进行数据标准化筛选高可变基因并进行主成分分析• Harmony算法校正批次效应• 基于校正后的主成分进行图聚类和UMAP降维聚类结合已知标记基因进行细胞注释• FindAllMarkers函数筛选差异表达基因• velocyto.R包进行RNA速度分析推断细胞分化轨迹• pySCENIC进行转录因子调控网络分析鉴定关键转录因子• AddModuleScore函数进行基因集signature评分。空间转录组测序• Space Ranger完成原始数据的质量控制和比对• Seurat包过滤低质量spots进行数据标准化• 主成分分析后进行聚类分析结合单细胞转录组的signature进行spots注释• SpatialFeaturePlot函数绘制基因和signature的空间表达图谱• AddModuleScore函数进行细胞亚型signature评分分析共定位特征• 进行基因本体论富集分析解析特定聚类的功能通路。批量RNA测序与基因芯片• 基于单细胞RNA测序的细胞注释结果利用CIBERSORTx构建细胞类型参考特征矩阵• 通过该矩阵反推批量RNA测序和基因芯片数据中的细胞类型浸润比例• 进行Spearman相关性分析解析细胞类型间的浸润相关性• 结合临床数据分析细胞浸润与患者生存的关联• 进行基因集富集分析解析不同细胞浸润特征下的通路富集情况。组学联合分析• 整合单细胞RNA测序的细胞亚型特征与空间转录组的空间定位信息验证FAP成纤维细胞与SPP1巨噬细胞的共定位特征• 结合单细胞RNA测序的基因表达数据利用NicheNet包分析FAP成纤维细胞与SPP1巨噬细胞间的配体-受体相互作用鉴定关键调控分子• 整合批量测序的临床队列数据与单细胞测序的细胞亚型特征验证细胞浸润的临床相关性• 结合免疫治疗队列的基因表达和临床数据分析FAP/SPP1表达与免疫治疗疗效的关系。统计分析• 采用配对双侧Wilcoxon符号秩检验比较肿瘤与癌旁组织的通路富集和细胞比例差异• 配对双侧Student’s t检验比较肿瘤与癌旁组织的细胞亚型比例、分子表达水平差异• Spearman相关性分析解析细胞类型间的浸润相关性以|Rs|0.3且FDR0.05为显著相关• log-rank检验分析细胞浸润/基因表达与患者生存的相关性• Cox比例风险模型计算风险比及95%置信区间• one-way ANOVA检验比较不同细胞浸润亚组的分子特征差异• Fisher’s检验进行基因本体论富集分析和免疫治疗响应率的组间比较• 非配对双侧Student’s t检验比较健康人与结直肠癌患者的血浆趋化素水平。所有统计分析以p0.05为差异具有统计学意义。总结研究意义本研究首次系统解析了结直肠癌中FAP成纤维细胞与SPP1巨噬细胞的肿瘤特异性特征、分化调控机制及二者的相互作用模式明确了该相互作用在构建免疫排斥性肿瘤微环境、促进促纤维增生结构形成中的关键作用揭示了FAP/SPP1高表达与结直肠癌患者免疫治疗耐药的相关性。研究为结直肠癌肿瘤微环境的调控机制提供了新的视角提出了通过破坏FAP成纤维细胞与SPP1巨噬细胞相互作用来改善免疫治疗疗效的潜在策略为结直肠癌的精准免疫治疗提供了新的靶点和理论依据。文章复现这篇文章的原始数据和生信分析代码都公开了非常全面。原始数据• 单细胞RNA测序和空间转录组测序原始数据存档于基因组序列档案库登录号为HRA000979• 结直肠癌公共单细胞转录组数据下载自GEO数据库编号包括GSE146771、GSE132465、GSE144735TCGA数据库获取结直肠癌批量RNA测序数据• GEO数据库获取结直肠癌基因芯片数据编号包括GSE41568、GSE39582、GSE37892等• 免疫治疗数据来自IMvigor210队列。生信分析代码• 代码基于R 3.6.0实现仓库地址为https://github.com/youqiongye/CRC_scRNAseq/tree/V1.0.0。推荐课程中国银河生信云平台UseGalaxy.cn致力于零代码生信分析。平台拥有海量计算资源、3000 多个生信工具和数十条生信流程并且为用户提供 200G 免费存储空间。进群交流请先加 usegalaxy 为好友。我们还为进阶用户提供高质量培训课程转录组数据分析实战仅需99元视频版